DIAGNOSTICO DE LA INFECCION POR PAPILLOMA VIRUS POR AMPLIFICACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS Introducción Hay fuertes evidencias que asocian la presencia del Papilloma Virus humano y el desarrollo de cáncer del cérvix. En varios estudios realizados por diferentes instituciones, se ha demostrado la presencia de HPV  en más del 90% de mujeres con cáncer de cérvix diagnosticado; la magnitud de la asociación entre HPV y carcinoma de células escamosa e mas grande de la asociación entre cigarro y cáncer del pulmón.  En 1996 la Asociación Mundial de la Salud declaró el HPV como un importante agente del cáncer cervical. Mundialmente el cáncer del cérvix uterino ocupa el segundo lugar entre las neoplasias malignas, se hace evidente por lo tanto la necesidad de un método predictivo de buenas características. A la fecha se han identificado mas de 80 tipos de HPV,  los tipos asociados a enfermedades del tracto anogenital se han clasificado en base a sus relaciones filogenéticas y en base al desarrollo de lesiones cervicales malignas o benignas como tipos de alto riesgo (HPV-16,-18,-31,-33,-35,-39,-45,-51,-52,54,-56,-58,-59 y -66) y tipos de bajo riesgo(HPV-6,-11,-34,-40,-42,-43,-44).  Los tipos de alto riesgo más comunes son HPV-16, -18, -31, -33, y 45.  Los tipos de bajo riesgos mas frecuentes son HPV-6 y -11.  El Papilloma virus pertenece a la familia de los Papovaviridae,  su capside es icoesaedrico (visto al microscopio electrónico se parece a una pelota de golf) y se compone de dos proteínas principales L1 y L2. El genoma consiste de un filamento doble de DNA circular de un tamaño aproximado de 7,900pb que se divide en tres regiones principales La primera (Long Control Region) LCR es una región controladora de la replicación del DNA.  La segunda región contiene los genes E (E1,E2,E4 E5,E6 E7) que codifican las proteínas necesarias en la replicación y oncogénesis del virus y la tercera región posee los genes L1 y L2 que codifican las proteínas del capside.  Factores que incrementan el riesgo de una infección con HPV son: actividad sexual a temprana edad, promiscuidad o un compañero promiscuo. EL uso de preservativos no es suficiente para prevenir la infección que puede ser transmitida por el contacto entre labios vaginales infectados, el escroto o tejido anal.  Además de la actividad sexual, la edad es un factor importante en el riesgo de la infección por HPV; a nivel de la unión escamocolumnar ocurren continuos cambios metaplasicos y las tasas mas altas se dan entre las mujeres fértiles de edad joven, el riesgo mayor de infección por HPV coincide con la alta tasa de cambios metáplasicos.  Por lo tanto, la frecuencia de infecciones es mas alta entre la población de mujeres jóvenes (18-30 años) sexualmente activas y va disminuyendo conforme aumenta la edad. Al contrario la tasa de cáncer cervical aumenta a partir de los 35 años, esto sugiere que las infecciones en mujeres jóvenes progresan lentamente hasta el aparecimiento del cáncer.  Hay que aclarar que la infección por una cepa de HPV de alto riesgo, aún siendo predisponente de por sí no es suficiente para el desarrollo del cáncer y se necesitan otros factores concomitantes que pueden, en conjunto con el HPV, desencadenar el proceso canceroso (tabaquismo, el uso de contraceptivos orales, alcoholismo etc.). El virus del HPV se une a la célula blanco (célula basal del epitelio escamoso estratificado) vía hepáran sulfato, el mecanismo o el receptor específico para su ingreso a la célula todavía se desconoce.  A nivel de la célula basal el virus se replica de acuerdo con la replicación celular y por lo tanto adquiere la característica de un episoma de bajo número de copias. Mientras a nivel del queratocito el virus se replica por el mecanismo de circulo rodante y su DNA se amplifica en un alto numero de copias, luego   se transcriben las proteínas del capside y el virus se ensambla nuevamente.  Entre los productos de los genes virales son particularmente importantes las proteínas E6 Y E7, estas inhiben las proteínas celulares p53 y pRB que en la células normales funcionan como señales apoptoticas  y previenen la duplicación de células tumorales.  La trascripción de los genes virales E6 y E7 es regulada por la proteína producto de E2 (inhibidora de la trascripción de E6 y E7). Entre las características de las cepas de alto riesgo de HPV está la de poderse integrar al núcleo celular, la integración provoca la delección del gen E2 y el resultado es que ya no hay regulación sobre E6 y E7 por lo tanto la célula hospedera pierde los controles de las proteínas p53 y pRB lo cual aumenta el riesgo de mutaciones y la posibilidad que la célula se torne cancerosa. Una detección temprana del HPV y su tratamiento evita que las lesiones precancerosas se transformen en cáncer. A la fecha el diagnostico se ha realizado por la tinción de Papanicolau. Debido a la  gran cantidad de variables que hay que controlar en un examen citológico la tasas de resultados falsos negativos puede llegar al 30%.  El error humano es talvez la principal causa de tantos resultados falsos negativos, considere que un frote contiene un promedio de 50,000 – 300,000 células que hay que evaluar, una pequeña cantidad de células anormales se pueden perder en el entorno celular normal. El uso de la PCR ha venido aumentando gracias a la gran sensibilidad de la metodología (detecta a partir de 10 copias de HPV por muestra)  y también por el hecho de que el diagnostico de screening se ha abaratado en los últimos años.  La utilización de la PCR y la aplicación de sondas específicas permiten la genotipificación adicional de las cepas de bajo y alto riesgo para lograr por, lo tanto, un diagnostico certero de la infección.  Toma de muestra Numerosos estudios realizados evidenciaron que el uso del cepillo citológico asegura una mayor celularidad y por lo tanto amplifica la sensibilidad de la prueba.  La figura a continuación es bastante explicativa respecto al procedimiento que hay que aplicar. Rote el cepillo durante diez o quince segundos y después sumérjalo en el tubo de la solución de transporte. Notas Importantes: Previo a la toma de la muestra se recomienda realizar una limpieza del área utilizando un hisopo de algodón para eliminar el material mucoso que siempre es abundante en la cerviz.  La reacción en cadena de polimerasa puede ser inhibida por varios agentes entre ellos la hemoglobina, evitar toma de muestras durante o inmediatamente después al periodo menstrual   y evitar en lo mas posibles sangrados durante el muestreo. Los materiales necesarios para el transporte de la muestra le serán proporcionados por el laboratorio, por favor solicítelos a los teléfonos: 2334 0239 / 2334 0240 Fundamento de la Prueba Prueba de screening: Amplificación de la región L1 del HPV, sensibilidad de 50 copias del genoma de HPV en 5ml de extracto de DNA.  El amplificado tiene un tamaño aproximado de 450pb. Genotipificación: El amplificado positivo de la prueba de screening se ensaya con primers específicos para las cepas HPV 6,11,16,18,31,33,35 y 45. La sensibilidad es de 5ng de DNA en los 20ml del producto de la amplificación.